1937年夏，在上海为麦伦中学导演《三王》一剧，参加爱国联合公演，先后与张庚、于伶等结识，从事救亡剧运。同年冬参加青鸟剧社。1939年于伶等筹建上海剧艺社，他导演了首演剧目《人之初》，获得成功。之后，又排演了不少优秀剧目及世界名剧，导演艺术日臻成熟，与黄佐临、费穆、朱端钧合称为“孤岛四大导演”。

抗战胜利后，与顾仲彝等创立上海市立实验戏剧学校，任教务长，掩护田汉、安娥、洪深、欧阳予倩等留校任教，领导师生参加反饥饿游行等进步活动后被迫辞职，转入南京国立戏剧专科学校任教授。

中华人民共和国成立后，为苏州市第一届人民代表大会代表，被苏南公署聘任为国立社教学院教授、戏剧组主任。1949年底参军后，任华南军政大学文艺系副主任、中国人民解放军第三野战军政治部文艺干部训练班副主任。1952年调上海科学教育电影制片厂任副厂长，1957年9月调上海戏剧学院，翌年任副院长并兼任研究室、导演系主任。1979年执导《霜天晓角》，在话剧舞台上树立起鲁迅的生动形象，获文化部演出奖。1979年当选为中国戏剧家协会理事，中国文联全国委员。

吴仞之导演的戏主题思想鲜明，逻辑性强，哲理性突出，剧情发展和人物贯穿行动合情合理，以真实、淳朴、深刻、细致、精巧的手法，感人以情，动人以理。他主张导演应该以逻辑思维与形象思维并重。他对各种戏剧学派均有研究，博揽众长。教学上因人施教，不拘一格。1941年发表的《舞台与四次元空间》，第一次提出如何在舞台上运用时空结合的“四维空间”学说，至今仍有实践意义。

《霜天晓角》演出后，专心著作，完成《仞之艺文集》4卷。